올바른 조직 파쇄방법의 선택

적절한 조직 파쇄방법을 결정할 때, 아래 사항들을 고려하시기 바랍니다:

• 샘플유형: 어떤 샘플을 파쇄하려고 하시나요? 샘플의 탄성은 샘플의 종류에 따라 다양합니다. 예를 들어 뇌(brain)과 비장(spleen)과 같은 부드러운 조직은 뼈와 같은 단단한 조직에 비해 균질화(homogenize)가 쉽습니다. 단단한 샘플의 경우 stainless steel 비드를 이용한 비드비팅 (bead-beating)과 같은 좀 더 강력한 방법이 필요합니다.
• Target Molecules: 무엇을 분리하고자 하며, 어디에 위치해 있습니까? 핵산 추출(nucleic acid isolation)과 단백질 추출 (protein isolation)은 다른 파쇄 방법 또는 시약이 필요합니다. 이와 유사하게, 미토콘드리아 단백질 분리방법 (mitochondrial protein isolation)과 전체 단백질 분리방법 (total protein isolation) 도 다릅니다.
• 필요 수율 (Required Yield): 다음 단계를 수행하기 위해 얼마나 많은 DNA, RNA 또는 단백질이 필요합니까? 추출 방법에 따라 수율이 높아질 수 있지만, 시간이 더 걸리거나 비용이 많이 들 수 있습니다.
• Downstream Application: 분리한 물질로 어떤 실험을 진행하려고 하시나요? 조직 샘플 파쇄에 흔히 사용되는 특정 시약의 경우 특정 실험과는 호환되지 않는 경우도 있습니다. 예를 들어 분리한 관심 단백질로 효소 분석을 수행하려는 경우, 단백질의 기능을 유지하거나 복원해 줄 수 있는 파쇄 방법을 선택해야 합니다. (즉, 단백질이 변성되지 않는 파쇄방식 사용).
• 샘플 수량: 한번에 처리할 샘플 수가 많거나 자주 진행해야 하나요? 그렇다면, 다양한 조직과 세포의 파쇄에 최적화되어 있는 Fastprep® 장비 와 같은 안정적이고 효율적인 전문 장비를 사용하는 것을 고려해 보세요
• 예산: 어떤 장비를 이미 보유하고 있는지, 얼마나 많은 비용을 지출할 수 있는지를 고려하세요. 조직 파쇄 방법은 비용면에서 상당히 다양할 수 있으며, DIY 방법은 비용이 저렴하고, high throughput 방법은 더 비쌉니다. 저렴한 매뉴얼 방법 (home-brew)은 특정 분야 및 실험실에서는 충분할 수 있지만, 문제 해결(troubleshooting)과 최적화(optimizing)에 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 연구가 지체되는 것을 막기 위해 ready-to use 버퍼와 동급 최강의 비드비팅 기술을 사용하는 것을 고려해 보십시오.

조직 샘플의 물리적인 파쇄

물리적인 파쇄는 조직을 균질화 하고 핵산이나 단백질을 추출하기 위해 비드(beads)나 막자사발과 같은 도구와 고속의 shaking (또는 수동분쇄)을 사용합니다. Bead beating 방법은 약한 충격에서 강한 충격까지 다양하게 설정할 수 있어서, 샘플이 단단한지 (예, 뼈) 부드러운지(예, brain)에 상관없이 모든 샘플 타입의 파쇄에 사용할 수 있습니다. 물리적 파쇄 방법은 특히 탄성이 있는 샘플을 파쇄할 때는 국부적인 열이 발생할 수 있기 때문에, target molecules을 온전하게 유지하기 위해서는 저온 조건 (cryogenic grinding)을 유지해야 할 수 있습니다.

물리적인 파쇄의 비용은 가격과 처리양에 따라 다양합니다. 막자사발을 이용한 매뉴얼 방식의 grinding은 저렴하지만, 시간이 오래 걸리고, 샘플간 파쇄의 일관성을 유지하기가 어렵습니다. Bead-beating 방법은 가격대가 비교적 저렴한 제품에서 비싼 제품까지 다양하고, 효율적이며, 대량샘플 취급 시 쉽게 자동화 시스템으로 전환할 수 있습니다.

조직 샘플에서 핵산이나 단백질을 추출하기 위해 일반적으로 사용되는 Bead beating lysing matrices 종류:

• Lysing Matrix A: garnet matrix 와 큰 ceramic spheres 조합
• Lysing Matrix D: Ceramic spheres
• Lysing Matrix S: Stainless steel
• Lysing Matrix Z: Yttria-stabilized zirconium oxide beads

또한, FastDNA-96 Tissue & Insect DNA Kit와 같은 시중에서 판매되고 있는 키트를 사용하여, 조직 샘플 prep을 간소화할 수 있습니다.

시약에 의한 조직 Lysis (Liquid-based Tissue lysis)

시약에 의한 cell lysis는 세포나 조직의 membranes을 약화시키거나 분해할 수 있는 detergent나 buffer를 포함하는 용액을 사용하는 것을 말합니다. 단백질 기능을 유지하면서 막 단백질 (membrane protein)을 용해시키기 위한 방법으로는 nonionic (예, Triton-X, NP-40)과 zwitterionic (예, CHAPS) detergent를 사용합니다. Ionic detergents(예, sodium deoxycholate, Sodium Dodecyl Sulfate)는 강한 solubilizing agents로 단백질을 분해하고, 단백질 활성을 없애게 됩니다.

RIPA buffer는 부드러운 조직에서 단백질을 추출할 때 일반적으로 사용되는 버퍼입니다. 이 버퍼는 SDS-PAGE 와는 호환 가능하지만, immunoprecipitation에는 적합하지 않습니다. 따라서 downstream application에 따라 단백질간 interaction에 간섭을 피하기 위해서는 dialysis 가 필요할 수 있습니다. RIPA buffer는 Tris-based solution으로 NP40, Sodium deoxycholate, sodium dodecyl sulfate(SDS)를 함유하고 있습니다.

• RIPA buffer 제조법 : 25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1% sodium deoxycholate and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS).

RIPA buffer의 대안으로는 단백질 활성은 유지하면서 membrane을 약화시키고 lysis 를 촉진하기 위해 protease & phosphatase inhibitor cocktail이 포함된 hypotonic lysis buffer를 사용할 수 있습니다.

초음파 파쇄 (Sonication)

하이브리드 접근 (Hybrid approach)

샘플 파쇄방법을 최적화 하기위한 팁!!

요약

적절한 조직 파쇄방식을 선택하는 것은 성공적인 실험을 설정하는데 있어 중요한 단계입니다. 물리적 파쇄, 시약에 의한 균질화, sonication 방식 중 선택할 때 고려해야 할 몇 가지 요소가 있지만, 때론 하이브리드 접근방식이 필요합니다.

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